辐照灭菌剂量确认的微生物学方法

产品的无菌保证水平是指一个体系经过灭菌操作后达到无菌状态的概率，要确定一个产品的无菌状态，必须要符合欧洲标准EN556的条件，EN556规定无菌保证水平为10-6，即每一百万细菌中有一个存活的概率。

ISO 11137-2-2006中规定了如何确定辐照产品的无菌保证水平。（医疗器械的灭菌，辐照灭菌，第二部分，灭菌剂量的确认）

剂量确认的方法

ISO 11137-2-2006中有两种方法来确认灭菌剂量使产品达到某一无菌保证水平，分别是方法一和方法二，下面列出了这两种方法的原理和过程。

方法一

方法二可用来确定：为了达到某一无菌保证水平所需的辐照剂量，在这种方法中，我们需要用到一个反映微生物耐受剂量的标准表格。

第一步：测定初始生物负载

为了做生物负载分析，至少要分别从三批独立的产品中抽出10个样品进行检测。生物负载分析必须按照一个经验证的、可行的方法进行分析。计算出每一批产品的平均生物负载，用30个样品的平均生物负载作为三批样品的总平均生物负载。如果三批产品中有一批的平均生物负载比总平均生物负载大两倍或两倍以上，就用此批的平均值来做剂量验证，否则，用三批的总平均值来做剂量验证。

第二步：获得验证剂量

一旦确定了原始生物负载量，就可以运用ISO 11137-2-2006标准中的参考表格确定达到10-2灭菌水平的剂量，使用该剂量处理100个样品得出的无菌实验结果，可以外推出10-6无菌保证水平对应的剂量是否合适。使用该参考表格时，产品中实际平均生物负载量应小于或等于表格中列出的生物负载量。

第三步：进行剂量验证试验

用参考表格确认的验证剂量辐照100个样品，所用验证剂量的相对误差不得超过±10%，然后将辐照后的产品移入无菌实验室进行无菌检测，每100个样品的无菌检测要独立进行。样品于30±2℃培养箱中培养14天， 对阳性结果进行计数。培养的14天内，定期观察阳性实验的数目。

第四步：结果解析

如果100个实验样品中的阳性数目少于2个，则接受该验证剂量。

第五步：建立灭菌剂量

通过查阅ISO 11137-2-2006标准中的表5可以确定达到某一无菌保证水平应采用的灭菌剂量。

方法二

方法2是用来确定达到某一特定的无菌保证水平所需的辐照剂量。由于微生物对辐照有耐受性，该剂量确定的过程是复杂的，并且需要一系列的计算工作。下面仅接受一下该过程的大致过程。

第一步：至少从三批独立产品中分别抽出280份样品进行分析。

第二步：每20份产品分别作为一个批次用不同的剂量辐照。至少以9个不同的辐照的剂量、

剂量梯度为2kGy(2, 4, 6, 8, ….., 18kGy)辐照以上样品，并对剂量进行监测。辐照后的产品分别进行无菌测试。

第三步：根据以上无菌试验的结果，查标准估计达到10-2无菌保证水平所需的剂量。通过第二步无菌试验的结果决定选择哪一批产品用来做进一步的无菌试验。从所选批次中选出100个样品用查表得出的剂量进行辐照处理，然后做无菌试验。

第四步：无菌试验的结果作为计算最低灭菌剂量的依据。

VDmax方法——25kGy或15kGy作为灭菌剂量的证实

ISO 11137-2-2006中也列出了如何对两种灭菌剂量（25 kGy、15 kGy）进行验证的方法。

这种方法被称为VDmax方法，和方法1的操作方法相似，因为该方法也需要进行原始生物负载量测定、剂量验证和无菌试验。

第一步：测定初始生物负载

至少从三批产品中抽出10份产品做生物负载分析。生物负载分析必须按照一个经验证过可行的方法进行分析。计算出每一批产品的生物负载，用30个样品的平均生物负载作为三批样品的总平均生物负载量。如果三批产品中有一批的平均生物负载量比总平均生物负载量大两倍或两倍以上，就用此批的平均值来做剂量确定，否则，用三批的总平均值来做剂量确定。平均生物负载的最大允许值如下：

VDmax  25kGy  1000cfu/件

VDmax  15kGy  1.5cfu/件

第二步：进行剂量验证试验

初始生物负载确定后，则可确认验证剂量。通过查ISO 11137-2-2006中的表9得出所需验证剂量。并按验证剂量对一批产品中的10份样品进行辐照处理。无菌保证水平为10-2。然后对10份辐照样品进行无菌试验。

第三步：结果解析

如果10份样品中不超过一份样品显示阳性，则接受设定的验证剂量，所选的灭菌剂量被验证。如果2份样品显示阳性，必须做第二次剂量验证。

第四步：灭菌剂量验证

从另一批样品中选出10分样品用灭菌剂量（VDmax  Dose）进行辐照，对辐照后样品进行无菌试验，如果没有阳性结果出现，则所选灭菌剂量（VDmax  Dose）验证通过。

日常灭菌剂量审核

日常剂量审核用来反映所建立的灭菌剂量的持续有效性，日常剂量审核是为了反映初始微生物负载对辐照的耐受性。

两种方法可用来确定日常剂量审核的周期。

选择3个月审核一次。

执行剂量审核之前对剂量审核的周期的选择要做合理的说明。

ISO 11137-2-2006中有关于前期灭菌剂量审核结果的标准和产品生物负载的稳定性的标准。最大的灭菌剂量审核周期是12个月。

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